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未来技术学院席鹏实验室证明多光子MINFLUX技术可以进一步提升分辨率和多色成像应用潜力

光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制,只能达到~200 nm的分辨率。在最近20年中,STED、SIM、PALM/STORM、DNA-PAINT等一系列技术,通过点扩展函数(point spread function, PSF)的调制,突破了光学衍射的限制,使光学分辨率最低达到20nm,得到广泛的生物应用并获得2014年的诺贝尔化学奖。

2017年,诺贝尔奖得主Stefan Hell(STED技术的发明人)发展了MINFLUX技术(MINimal photon FLUXes,最低光子数显微成像),并将其称为“后诺贝尔奖时代的显微技术”。MINFLUX进一步提升了光学分辨率,可以获得~1 nm的定位精度和~5 nm的空间分辨率。MINFLUX作为单分子定位技术,结合了STED与STORM两种技术的特点。与STED的淬灭光使用甜甜圈(donut)形状的中空光斑不同的是,MINFLUX使用donut光斑作为激发光;类似GPS定位的原理,MINFLUX使用甜甜圈光斑对荧光分子进行多次激发,进而可以通过统计学方法,估计出荧光分子的位置。

1 nm的定位精度已经与单个分子的大小十分接近。但定位精度不等于光学分辨率,分辨率并没有达到~1 nm的尺度,仍有提升的空间。是否有新的方法,可以进一步提升光学显微镜的分辨率呢?

北京大学的席鹏教授实验室从理论上证明了,将双光子激发(two-photon excitation, TPE)用于MINFLUX技术中,可以再将定位精度和分辨率提高2倍,获得小于1 nm 的定位精度。该结论以“”为题,发表于最新一期的eLight期刊。文章结果显示,双光子MINFLUX(Two-photon MINFLUX, 2p-MINFLUX)不仅可以提升2倍的定位精度,同时可以具有更为直接的多色成像潜力。

该工作得到了超分辨权威专家FernandoStefani教授课题组的点评,以“”为题发表于Light: Science & Applications。点评指出,该工作为多光子效应引入MINFLUX技术以及为今后MINFLUX应用于深层生物成像和实现更高定位精度提供了前瞻性理论基础。

MINFLUX的技术原理关键在于,donut光斑零点附近的梯度,远高于高斯光(Gaussian beam)顶点附近的梯度。MINFLUX使用donut零点附近进行定位,即可降低定位所需光子数量、提高定位精度。文章指出,由于双光子激发的非线性效应,荧光强度正比于激发光强度的平方,于是donut零点附近的梯度将被进一步提高(图1)。对比2p-MINFLUX和传统MINFLUX,在采集到同样荧光光子数的条件下,2p-MINFLUX理论上可以获得2倍的定位精度提升;若为获得同样定位精度,2p-MINFLUX只需要1/4的光子数即可实现。

图1直观对比和展示了2p-MINFLUX和现有1p-MINFLUX成像过程和结果。一方面,在2p-MINFLUX和1p-MINFLUX采集到同样荧光光子数的条件下,1p-MINFLUX无法分辨的结构,可由2p-MINFLUX分辨(图1b、c)。另一方面,在2p-MINFLUX和1p-MINFLUX达到同样定位精度时,2p-MINFLUX只需要1p-MINFLUX的1/4的光子数(图1c、d)。

图1. 双光子MINFLUX的模拟成像结果。该结果直观体现了2p-MINFLUX “定位精度2倍”和“光子数1/4倍”的关系

由于双光子非线性效应的存在,2p-MINFLUX将可能具有更为直接的多色成像能力;同时,2p-MINFLUX不仅可以作为超分辨成像手段,也可作为高速多色单分子追踪的方法。该技术可以进一步促进生物医学领域的基础研究,尤其是生物互作方面诸如核酸-蛋白互作、病毒-细胞互作的研究。

本工作的第一作者为北京大学未来技术学院博士生赵堃,赵堃同学也是北京大学-佐治亚理工学院-艾默里大学联合培养博士生。合作者为未来技术学院博士生徐鑫舳(也为联合培养博士生)、博士生任伟,以及南方科技大学金大勇教授。席鹏是本工作的通讯作者。本工作得到了北京市科委、深圳市科委、国家自然科学基金委、科技部等的基金资助。

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